王謙1，閆蕾蕾1，王超1，冀宏2，丁萬杰2，劉傳斌3，邢志華3，李寶佳3
(1河北大學生命科學學院食藥用真菌研究所，保定071002；
2河北省微生物研究所，保定071051；3保定市農業科學研究所，保定071000)
茯苓(P0r／a COCOS)又名茯菟，屬擔子菌亞門，多孔菌科，臥孔菌屬…，是我國傳統的常用中藥材，具有益脾健胃，安神守心，利水滲溫等功能[2]，開發價值及應用前景遠大。運用發酵工程手段，可在短時間內獲得大量茯苓菌絲體，進而進行工業化開發，這吸引了菌物學工作者的注意。本文報道了在工業發酵條件下茯苓的液體培養情況及其營養濃縮液的相關檢測。
1材料與方法
1．1供試菌株
茯苓菌株HPC-1，由河北大學生命科學學院食藥用真菌研究所提供，4℃低溫保存，每6個月轉管一次。
1．2主要設備
P270雙層搖床，武漢科學儀器廠產品；100L和1000L不銹鋼通用型發酵罐，鎮江東方生物工程設備技術有限責任公司產品；Beckman Du一7型紫外分光光度計，美國Beekman公司出品。
1．3發酵工藝
1．3．1發酵培養基在適宜碳氮源試驗基礎上，確定供試培養基為：玉米粉0．5％，豆餅粉0．5％，葡萄糖2．5％，酵母膏0．3％，磷酸二氫鉀0．1％，硫酸鎂0．1％，pH自然。
1．3．2發酵培養條件菌種使用前于室溫下活化過夜，再于25±1℃下，24h前180r／min、其后220r／rain搖瓶培養，培養周期196h。發酵罐培養中，O．11rnPa空消50rain，后O．10mPa實消30min，裝液量60％，加消泡劑0．01％，冷卻至25℃壓差法接種。菌齡96～120h，通氣量1：0．5～1：1。經工藝優化篩選試驗后確定的茯苓發酵工藝流程為：
放罐標準為菌絲生物量達到30g/100mL(鮮重)，無雜菌，鏡檢菌絲無破壁現象，鎖狀聯合豐富。醪液經破壁處理、低溫提取、減壓濃縮后即獲得其營養濃縮液，進而進行相關檢測。
1．4分析測試
1．4．1常規分析以80目銅絲網過濾稱重，測定菌絲體鮮重；用pHS-3型數字式pH計測定 pH值；用菲林法測定還原糖[3]；用酚一硫酸法測定多糖含量[4]；用日立835-50型氨基酸自動分析儀測定氨基酸；用色譜質譜聯測分析測定發酵液中的有機酸含量，該檢測由河北大學理化中心完成。
1．4．2營養濃縮液的動物試驗按照衛生部保健食品功能學評價程序與檢測方法中有關內容和試驗方法進行抗疲勞作用檢測(負重游泳試驗)和免疫調節作用檢驗(遲發型變態反應試驗，小鼠腹腔巨噬細胞吞噬紅細胞試驗)，試驗動物由河北醫科大學實驗動物中心提供。
1．4．3營養濃縮液理化分析及毒性試驗試驗由河北省衛生防疫站完成，急性毒性試驗用霍恩法進行。
2結果-9分析
2．1搖瓶試驗
0-48h為適應期，菌絲生長緩慢；48～144h為增殖期，菌絲生長速率加快；144h后則進入穩定期，菌絲生物量基本保持在一個水平(表1)。在正常培養情況下，進入增殖期后伴隨著菌絲生物量的增長，pH值急劇下降，降至2．5左右才趨于穩定。
大部分食(藥)用菌液體深層培養過程中pH值變化不大，相比之下，茯苓液體深層培養情況較為特殊，其還原糖的消耗速率亦較靈芝和金針菇的慢[5,6]，筆者在香菇液體深層培養過程中亦曾發現同樣的情況L7 J，為此我們測定了發酵液的有機酸組成(表2)。
其中，274峰為軟脂酸十六烷酸，351峰為硬脂酸十八烷酸，二者均是亞油酸和亞麻酸的重要合成前體，哺乳動物是不能自身合成這些生物膜的重要組成成分的。茯苓液體深層培養過程中產生的軟脂酸和硬脂酸不僅具有學術價值，也具有潛在的經濟價值。該方向的研究將繼續深入進行。
2．2發酵罐培養
由于發酵罐培養條件優于搖瓶，因此培養周期較短，120h即可達到30d100mL的生物量指標，放罐進入后處理。研究中發現，將裝液量調整為50％后，可通過調整通氣量來改善發酵液中的溶氧量。在培養中期停止攪拌以減少機械作用對菌絲的破壞作用，是一項有效的工藝。菌種上罐前經24h肉湯培養，結合鏡檢確認有無雜菌感染，是一種穩妥的菌種檢驗方法。
2．3營養濃縮液的相關檢測
培養120h的茯苓發酵醪液經細胞破壁處理，低溫提取，減壓濃縮，復配和穩定處理等步驟后即獲營養濃縮液。其氨基酸總量≥480mg]lOOmL(其中44％為必需氨基酸)，多糖總量≥5．0mg／mL，總酸≥5．36％，重金屬及微生物指標均符合國家標準。毒性檢驗結果LDso>21．5g/kg，屬于安全無毒。
2．3．1茯苓營養濃縮液的抗疲勞作用 經比較，茯苓營養濃縮液可顯著延長小鼠游泳耗竭時間，具有明顯的抗疲勞作用(表3)。
2．3．2茯苓營養濃縮液對小鼠腹腔吞噬細胞吞噬功能的影響試驗發現，注射茯苓營養濃縮液組小鼠巨噬細胞的吞噬功能明顯高于對照組(表4)，表明該營養濃縮液具有明顯提高機體免疫功能的作用。
3結論
3．1在本研究提供的條件下，茯苓菌株HPC-1經發酵培養120h后，生物量≥30g／100mL(鮮重)。
3．2發酵過程中pH驟降，在發酵液中檢測到了包括十六烷酸、十七烷酸和十八烷酸在內的有機酸。
3．3營養濃縮液安全無毒，多糖含量≥5．0mg／mL，氨基酸含量≥480mg/100mL，并具有顯著的抗疲勞作用和提高小鼠巨噬細胞吞噬功能的作用。
致謝：本課題得到河北大學理化中心郭志峰教授、河北醫科大學張永健教授大力幫助，在此一并致謝
參考文獻
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