秦俊哲 魏穎杰 陳 合 呂嘉櫪
（陜西科技大學生命科學與工程學院， 陜西咸陽 712081）
金針菇ВFlammulina velutipes）Э諼斷拭潰營養豐富，具有防病抗癌功能，可促 進兒童健康成長和智力發育。近年來，其消費量迅速增加，國外金針菇生產已基本實現了工 廠化，國內在引進國外技術的同時也逐漸形成了一套適合國情的規?；苣晟a技術。但金針菇菌種生產仍采用固體發酵法，存在生長周期長、菌齡不一致、操作不方便等缺點，而以 液體菌種進行擴大繁殖是規?；a的發展方向。有關金針菇菌種液體培養技術的研究雖有一些報道［1～3］，但多以利用發酵液或菌絲體為目的，對培養過程中影響菌絲活性 的生理指標研究甚少，目前尚缺乏有效控制發酵過程的生理指標和技術參數。本文通過研究影響菌絲生長的主要生理指標，如菌絲球數量、pH、還原糖和氨基氮含量以及酶活性與菌絲 生長活性的關系，為金針菇液體菌種工廠化生產過程的控制提供技術參數和科學依據。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌種 ソ鷲牘驕種“金18”由武漢市新育食用菌研究所提供。
1.1.2 培養基 バ泵媾嘌基：PDA培養基；搖瓶培養基：米粉3%，赤砂 糖1%，酵母膏1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，VB110μg/100mL，VB250μg/100mL 。
1.1.3 儀器與設備 YJ型超凈工作臺，江蘇省蘇州市蘇凈集團安泰公司 產品；3033型恒溫培養箱，江蘇省東臺電器廠產品；YX280型手提式壓力蒸汽消毒器，上海醫療器械工業公司產品；SHZB型水浴恒溫振蕩器，上海躍進醫療器械廠產品；722型分 光光度計，上海精密科學儀器有限公司分析儀器總廠產品；8002型電熱恒溫水浴鍋，北京化玻聯醫療器械有限公司產品；pHep型pH計，意大利HANNA公司產品。
1.2 方法
1.2.1 斜面菌種的活化 ソ菌種接于PDA斜面培養基上，于25℃恒溫培 養7d，作為下一步搖瓶培養的一級菌種。
1.2.2 搖瓶菌種的制作與培養 ビ500mL三角瓶，培養基裝量150mL，于 121℃、0.12MPa壓力下滅菌30min，冷卻后每瓶接入3塊1cm2培養7d的斜面菌種，150r/min 搖床培養8d，培養溫度為25℃，每天取一瓶檢測各項指標。
1.2.3 指標測定
1.2.3.1 菌球計數 吸取1mL培養液稀釋至10mL，取1mL稀釋液置平皿中，皿下襯黑白相間方格紙計數。
1.2.3.2 pH值測定 用pH計測量培養液的pH值。
1.2.3.3 還原糖測定 用3，5捕硝基水楊酸法［4］。
1.2.3.4 氨基氮測定 用甲醛滴定法［5］。
1.2.3.5 羧甲基纖維素酶（CMC酶）活性測定用3，5捕硝基水楊酸法［5］， 培養液濾液中羧甲基纖維素酶活性單位定義為1U＝1mg葡萄糖/30min·mL。
1.2.3.6 漆酶活性測定 取0.5mL13.36mM的聯苯胺作為底物，加入3.4mL 0.1M、pH4.6的 HAC緩沖液，加入0.1mL發酵濾液，于28℃下反應30min，在600nm處測OD值。同時，以0.1mL 煮沸的發酵濾液代替原液作空白對照。培養液濾液中漆酶活性單位定義為1U=ΔOD/min·mL ［6］。
WX(16，241.2.3.7 蛋白酶活性測定 用Worthington法［7］，培養液濾液中蛋白酶活性單位定義為1U＝1mg酪氨酸/15min·mL。
2 結果與分析
2.1 培養液菌絲球數量的變化
ッ扛24h測定培養液的各項生理生化指標并觀察菌絲球形態。菌絲球數量的變化情況如圖1 所示。
ビ賞1可以看出，培養初期，菌絲球數量增長緩慢，培養第3～6天為菌絲球增長旺盛期，第7天菌絲球數量達到峰值。然后，隨著培養液中營養
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ね1 金針菇液體菌種培養液菌絲球數量的變化
Fig. 1 Variation of mycelial pellet nos.in thefermentative liqu id of WTHXF. velutipesWX)
成分的減少及菌絲活性的減弱，菌絲生長速度開始下降。此生長曲線符合金針菇的一般生長規律。
2.2 培養液pH值的變化
ネ2顯示，液體培養期間，培養液的pH變化很小，基本上保持不變，在培養末期略有上升。這是因為金針菇液體培養初期菌絲分解基質產生部分有機酸，培養末期，由于菌絲球老化 自溶產生氨基氮等堿性物質，使培養液的pH略微升高。如果培養后期pH明顯降低，溶液渾濁產生泡沫，多為雜菌污染所致。該結果與劉陽等的報道［8］基本一致。
KH10*2
ね2 金針菇液體菌種培養液pH值、還原糖和氨基氮含量的變化
Fig. 2 Variation of pH,reducing sugar and amino nitrogen contents in th e fermentative liquid of WTHXF. velutipes J1
2.3 培養液還原糖及氨基氮含量的變化
ゴ油2可以看出，培養初期，培養液中還原糖含量較低，隨著培養時間的延長，還原糖含量迅速增長，培養中期還原糖含量變化平緩，后期又下降，第6天降至3.40g/100mL。培養初 期，雖然菌絲生物量不大，但分解碳源物質的能力很強，還原糖的生成量大于利用量，所以此期間還原糖含量呈上升趨勢。隨著培養基中碳源物質的消耗和菌絲球數量的增長，培養后 期還原糖含量迅速下降。
ヅ嘌液中氨基氮含量在培養前期變化不大，增長趨勢比較平緩，隨著培養時間的延長，其含量逐漸增加；培養后期氨基氮含量迅速增長，第7天達到11.10mg/100mL。這是由于培養后 期部分菌絲體蛋白質分解產生氨基氮類物質及菌絲球老化自溶釋放出氨基氮類物質所致。
2.4 培養液酶活性的變化
ネ3顯示，培養1～3d，培養液中纖維素酶活性較低，第3天后，纖維素酶活性逐漸增加，第5～6天，纖維素酶活性基本上保持在1.10U左右，為平臺期。金針菇依靠自身分泌的各種 酶分解基質中的碳源物質來提供生長發育所需要的能量和營養，而纖維素是一種高分子結構的碳源，必須在纖維素酶作用下才能夠分解［9］。因此，菌株纖維素酶活性的高低 可反映菌株活性的強弱。
テ崦富钚緣腦齔け冉匣郝，其變化不明顯，峰值出現在第6天，之后，漆酶活性的變化漸 趨平緩，與金針菇的生長曲線基本吻合。本試驗中漆酶活性可達0.017U。漆酶是降解木質素 大分子物質的主要酚氧化酶，它能加速木質素芳香族高分子化合物的分解，提供菌絲所需的營養［9］。胞外漆酶活性越高，菌株分解能力越強。因此，漆酶活性可作為反映金 針菇菌絲細胞活性的指標。若漆酶活性強，則底物分解快，菌絲生長速度加快。此外，漆酶代謝所產生的醌類物質的增加，還可以增強菌種的抗病能力，抑制雜菌污染。本試驗漆酶活 性的變化不明顯，這與培養基中缺乏木質素成分有關。
ネǔＨ銜蛋白酶是在基質中可吸收氮源缺乏的情況下，為了獲得蛋白質中的氮素而產生的［9］，而蛋白酶的主要作用就是分解肽鍵，使蛋白質降解為小分子的蛋白胨、多肽 或氨基酸等
WX(20。2物質［10］。圖3顯示，金針菇液體菌種培養液中蛋白酶的變化不大，趨勢比較平緩，峰值出現在第6天，酶活性為0.17U。這是由于在金針菇菌絲 生長過程中，對氮源的利用先于碳源，而蛋白酶是在有氮素需求的菌絲體中被大量誘導生成的。這說明金針菇的生長對氮源的需求量較低。 プ芴謇純矗三種酶的變化趨勢基本一致。培養初期，為菌絲的緩慢生長期，酶活性較低。 其后菌絲開始迅速增殖，從而分泌出大量的酶，基質分解速度加快，酶活性增大。第6天后，酶活性不再增加，基本上保持不變，達平臺期。培養后期，菌絲球逐漸進入衰退期，酶活 性亦呈下
ね3 金針菇液體菌種培養液酶活性的變化
Fig. 3 Variation of enzyme activity in thefermentative liquid o f WTHXF. velutipesWX)
降趨勢?？梢?，金針菇酶活性的變化與其生長趨勢基本相符。
2.5 菌絲球形態的變化
ソ鷲牘揭禾寰種培養過程中，對菌絲球的形態觀察結果表明，第1～3天為菌種塊萌發定植 期，培養液顏色清亮，菌絲片段增多，出現分枝；第4～6天，菌種塊沉沒，培養液中菌絲球 由小變大，邊緣呈絨毛狀，數量明顯增多，培養液變稠；第7天，菌絲球密度最大，但菌絲球顏色泛黃；此后，菌絲球邊緣變得光滑，密度漸減，菌絲球自溶加快，培養液變得渾濁。 此觀察結果與金針菇液體菌種培養液中的菌絲球數量、pH、還原糖和氨基氮含量及纖維素酶、漆酶、蛋白酶活性的變化情況基本一致。
4 結論
プ酆弦隕涎芯拷峁可以看出，在金針菇液體菌種培養過程中，菌絲球數量在第7天達到峰 值，但酶活性一般在第6天最高，這說明酶活性的峰值與菌絲球數量的峰值不是同時出現的 ，以酶活性的峰值作為液體菌種培養終點的參數比較合理。而且，在第6天，培養液中的還原糖含量也開始下降，氨基氮含量又有所上升，這表明菌絲球活性最強。繼續培養，則菌絲 球活性下降，說明培養終點應控制在第6天。因此，要想獲得質量好、產量高的液體菌種，將菌絲球的形態觀察結合培養液中菌絲球數量、pH值、還原糖和氨基氮含量，以及酶活性 的測定作為控制指標，是一種有效而可靠的監測方法。本試驗結果為金針菇液體菌種培養過程的控制提供了比較可靠的技術參數，若以該參數作為液體菌種實際生產中的控制指標，尚 有待進一步研究。
參 考 文 獻
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