堆積發酵將配方中的各種材料混合在一起，讓其腐熟發酵的過程。其目的為：使各種好熱性微生物在堆料中繁殖，把培養材料中的纖維素、半纖維素、木質素分解為蘑菇菌絲可以利用的化合物;所加入的氮素營養物質被各種微生物利用后，變成微生物的蛋白質，當微生物死亡后，菌體也就成了蘑菇可利用的有機氮;發酵過程中釋放的熱可以殺死料中的病蟲雜菌;經過發酵，堆料變得柔軟、疏松、通氣，具有優良的物理狀態。
1、堆料前的準備：糞肥應曬干，不要淋雨，若來不及曬干，則可挖坑倒入，拍緊，密封。用干糞堆積效果好，牛糞最好曬干至半干時粉碎成粉狀，再曬干透。稻草、麥稈等材料需選用新鮮、無霉爛的，使用前須切割成20-30cm長的小段，以便其吸水，也便于翻堆。
2、培養料的二次發酵：蘑菇培養料堆積腐熟發酵一般分兩個階段進行，前發酵，又稱一次發酵或室外發酵;后發酵，或稱第二次發酵，因其通常在室內進行，又稱為室內發酵。
(1) 前發酵：采用糞草培養料的，前發酵時間較長，需15～20天;采用以稻草為主的合成培養料的，前發酵時間需10～15天：以麥稈為主的發酵時間較長。麥草吸水力差，應浸泡2～3天，稻草吸水快，只浸泡l天即可。干糞在堆制時用水調濕潤。使用的糞和草均需先預濕。
(2)后發酵：后發酵方法有兩種，即固定床架式后發酵和就地式后發酵，后者就是將前發酵的料就地建堆后發酵，但以前者為主，將培養料移人菇房后再一次發酵。通常前發酵以化學反應為主，要求高溫快速;后發酵則是生物活動過程占優勢，要求控溫、控濕、通氣。
