(一)母種的制備
用試管制成斜面培養基，并接種原始試管種(保留種，并用于生產的母種即為生產母種，可用于擴接原種。
1．培養基配方
配方一 綜合馬鈴薯培養基
馬鈴薯 200克 葡萄糖20克 磷酸氫二鉀2克 硫酸鎂0.5克
維生素B110毫克 瓊脂20克 水1000毫升 PH值自然
配方二 合成培養基
馬鈴薯 20克 葡萄糖20克 磷酸二氫鉀2克 蛋白胨10克 牛肉膏5克
酵母膏5克 硫酸鎂0.8克 水1000毫升 PH值自然
2．培養基制作方法
先將馬鈴薯洗凈去皮切成簿片，稱取200克，加水1000毫升，煮沸15—20分鐘，用4層紗布過濾，取其濾液并補足水至1000毫升，加入瓊脂20克，再加熱，瓊脂溶化后，再加入其它配方中的藥品。
培養基的分裝，應在培養凝固前進行（瓊脂培養基40℃凝固）一般用漏斗，或分裝瓶，下端連接一段軟橡皮管，橡皮管下面再連接一水段玻璃管，在橡皮管上安裝一個止水彈簧夾，分裝時將玻璃管細口插入試管內，但不要碰到管壁，每支試管裝入量為度管長度1/4。裝好后塞上棉塞，每10支試管扎一捆，棉塞上用塑料紙封扎好，用線繩捆扎起來。
3．滅菌
將分裝后的試管扎捆好，放入高壓蒸氣滅菌鍋，在1公斤/厘米壓力下(鍋入溫度達121℃)滅菌20分鐘,使微生物包括芽子色全部殺死。待壓力降到0度時，慢慢放出鍋內氣體，趁培養基沒有凝固時，將試管擺成斜面。
4．接種、培養
通過無菌操作方法將菌種接入試管斜面上，置28℃、3天后將溫度降至24℃繼續培養，12—15天左右，菌絲長滿整個試管斜面，即成(生產)母種。
(二)原種、制備
母種接種到原種培養基上，進行擴大繁殖育種即為原種，原種一般采用廣口瓶或袋裝。
1．培養基配方
配方一 木屑麩皮培養基
闊樹木 78% 麩皮 20% 糖 1% 石膏粉 1% 水 65% PH值 自然
配方二 棉籽殼木屑混合培養基
棉籽殼 90% 糖 1% 麩皮 5% 過磷酸鈣 3% 石膏粉 1% PH值 自然
2．拌料與裝袋
選用新鮮無霉變原料，根據生產所需的數量，計算配料總量，將麩皮、石膏粉均勻的混合在培養料里，糖和過磷酸鈣溶于水解后，按上述干料量加入水，比例為1：1、3拌勻，培養料含水量60%為宜，含水量以手緊握培養料指縫間有水欲滴為宜。堆悶30分鐘后，裝瓶(袋)。用機械或人工裝袋稍加壓實。(塑料袋規格通常為9*21*0、04即，而袋寬9厘米，長21厘米，單層厚4厘米)實，在袋口外套入塑料環，形成象瓶子一樣，然后在袋口內塞松緊適宜棉塞、或用牛皮紙包扎好。
3．滅菌
原種滅菌方法有兩種，高壓滅菌和常壓滅菌。高壓滅菌又稱加壓蒸氣滅菌，滅菌原理：在高溫(120℃)、高壓(1公斤/厘米2)條件下滅菌2~3小時，將芽孢在內的微生物全部殺死。常壓滅菌稱流通蒸氣滅菌，由于滅菌設備、條件和基本因素的不同，溫度變動在90~103℃之間，其熱力、穿透力不強，在一定溫度下維持足夠時間達到滅菌目的，通常在100℃下維持8~10小時。
4．接種與培養
不論用接種箱或接種室接種，在接種前，需對接種箱或接種室用0、2%的來蘇水或漂白粉進行消毒處理，然后將滅菌過的料瓶(袋)放入接種箱內或接種室內，用紫外線燈照射30分鐘后，在無菌條件下進行接種，或在接種前用煙霧劑密閉薰蒸消毒。即煙霧劑點燃消毒時應關閉門窗。接種室消毒，一間房需點燃3盒50克規格煙霧劑；接種箱消毒每次僅用重量為40克，但又細分為20包的其中2包點燃即可(每包2克)。一般18×180厘米，母種試管每支可接4—6瓶(袋)原種。將接種后的菌種瓶(袋)放入發菌室培養。以培養室溫度22~26℃，相對濕度為80%以下，光線為弱散射光，發菌期間應保持良好的通風條件。原種從接種到菌絲長滿瓶(袋)需30—40天。
(三)栽培種制備
原種進一步擴繁，即為栽培種。栽培種一般采用塑料袋制備，規格為15×33×0、05，用無棉蓋體封口。一瓶原種可接50瓶(袋)栽培種。栽培種培養基配方及拌料、裝袋、滅菌、接種、發菌管理與原種用塑料袋制備時一致。
(四)、菌種質量鑒定
菌種質量不僅與能否成功發菌有關，也關系到產量和效益，從事木耳栽培必須嚴把質量關。菌種的質量鑒定有兩個方面的含義：一是分離培養的菌種是否是栽培所需種類。二是菌種是否為優良菌株。黑木耳菌種正常菌絲應潔白，生活力旺盛，發菌培養45天后，瓶(袋)間自上而下會出現菊花狀或梅花型膠質原基，顏色明褐至黑褐色。如果瓶(袋)底積淡黃色液體，或上半部出現黃色粘液，培養基收縮，為過期老化菌種，應予淘汰。
如果菌種菌絲僅發至瓶(袋)1/3~1/2處時出現淡黑色的膠狀耳基，說明菌種早熟，或擴大次數太多，或由于培養室光線過強。若菌絲只長一個角落而不蔓延，可能是培養基太干、過濕或干濕不均引起。若菌絲蔓延停止不前，并有一明顯抑制線，多為雜菌所致。在發菌過程中，發現雜菌應及時檢出不用。
