母種在分離或轉管過程中，需要防止雜菌污染。被霉菌污染時，一般初為白色菌絲，菌絲纖細，顏色發暗，2—3天后出現黃、紅、綠等雜色斑點，比較好識別。而被細菌、酵母菌污染時，由于它們沒有菌絲，是單個細胞分裂繁殖，因此，污染嚴重時，在試管中可發現其菌落隆起，表面光滑，不透明，似蠟燭油狀。轉接母種中的細菌菌量不多時，食用菌菌絲和細菌能同時生長；因細菌很小，桿菌和螺旋菌只有0.1一0.2微米，而食用菌的菌絲較粗，當細菌在競爭中不能形成菌落時，不易被肉眼發現，從而會造成母種的隱性污染。隨污染的程度不同，對食用菌母種長滿試管的時間及母種的健壯程度都有不同的影響，特別是用作轉接液體菌種影響更大。
預防和純化母種的辦法是：制作母種時，棉塞要松緊適度，接種要嚴格進行無菌操作。另外在配制母種培養基時，可在培養基內對入一定量的慶大霉素或氯霉索，能有效地預防母種污染。在生產中如發現菌絲生長緩慢、菌絲無原因地受阻，要立即淘汰。
