4 液體菌種生產關鍵環節和核心技術
4.1 搖瓶培養基配制 配制5L液體培養基，根據配方一稱取玉米粉100g，豆粕50g，麥麩25g，磷酸二氫鉀5g，硫酸鎂2.5g，蛋白胨5g，紅糖30g，葡萄糖25g，CMC-Na1g，放入不銹鋼鍋中，加水3000mL攪拌溶解，在電磁爐上煮沸持續20分鐘后，用雙層紗布過濾，將濾液加水至5L，調節pH6.5左右。制作小搖瓶分裝在500mL的三角燒瓶中，每瓶裝量250mL，并加人5粒小玻璃球，瓶口用棉塞和牛皮紙密封。制作大搖瓶分裝在5000mL的三角燒瓶中，每瓶裝量2500mL，并加入15粒小玻璃球，瓶口用棉塞和牛皮紙密封。
4.2 搖瓶培養基滅菌 配制好的搖瓶培養基，及時放人電腦控制滅菌器中，在0.13～0.15MPa壓力、121℃條件下，滅菌40分鐘。
4.3 搖瓶菌種接種 滅菌好的培養基，待溫度冷卻至28℃以下，在接種箱或超凈工作臺內無菌條件下接種。每小搖瓶投入約2cm的斜面菌種后。置于搖床上振蕩培養；培養后的小搖瓶菌種，擴接到大搖瓶內振蕩培養，每小搖瓶菌種擴接一瓶大搖瓶。
4.4 搖瓶菌種振蕩培養 大小搖瓶菌種均在搖床上往復振蕩，震蕩頻率為每分鐘80～100次，振幅為6～10cm，搖床室的溫度控制在24～25℃。一般小搖瓶菌種培養7天擴接到大搖瓶內培養。大搖瓶菌種培養3天擴接到發酵罐內培養。
4.5 發酵罐菌種發酵培養
4.5.1 發酵罐培養基配制。根據以上配方，稱量玉米粉2.6kg，豆粕1.3kg，麥麩0.65kg，磷酸二氫鉀0.131kg，硫酸鎂0.065kg，蛋白胨0.13kg，紅糖0.78kg，葡萄糖0.65kg，CMC-Na0.026kg，放入容積為200L不銹鋼鍋中，加水100L攪拌溶解，煮沸持續20分鐘后過濾，將濾液加水至130L，調節pH6.5左右，用增壓泵將濾液灌人發酵罐內。
4.5.2 發酵罐滅菌。液體培養基裝罐前，將發酵罐在壓力0.13～0.15MPa、溫度121℃條件下空消2小時，裝入液體培養基后，在相同條件下實消40分鐘。
4.5.3 液體菌種深層培養。待發酵罐液體內部溫度冷卻28℃以下。打開培養室內紫外燈照射40分鐘進行空間消毒。消毒結束后，在酒精火焰圈無菌條件下打開發酵罐接種口。將培養后的大搖瓶菌種(2500mL)擴接到發酵罐內，接入量為2%(v/v)。關閉接種口，同時打開控氣閥門，通人新鮮空氣，通氣攪拌培養。同時排出發酵過程中的廢氣。設定發酵罐內培養溫度23～25℃。發酵培養3天即可使用。培養過程中，每天取樣一次罐內液體，在顯微鏡下觀測有無雜菌感染，若發現污染，盡早處理。
4.6 菌種制作環境因素 嚴格消毒規程，保持接種室(接種箱)和培養室內適宜的溫度和干爽、清潔的空氣，降低空氣中雜菌基數，是提高菌種培養成功率的關鍵。另外，在空氣壓縮機房，接種車間都必須保持環境清潔衛生。
