組織分離是采菇體的部分組織進行繁殖母種的方法。盡管平菇的任何部分都能分離培養出母種，但是多年的實踐經驗表明，選用菌柄和菌褶交接處的菌肉最好。平菇組織分離的方法和步驟如下：
一、種菇選擇
一般選擇在適宜出菇期出菇早、出菇整齊、特征典型、無病蟲害、產量高的栽培袋，從中選擇菌肉肥厚、大小適中、顏色正常、尚未散孢、長至七八分成熟的優質菇作種菇。
二、種菇消毒
用0.1%升汞溶液或75%酒精浸泡或擦拭，無菌水沖洗，吸干表面的水分。
三、切塊接種
將分離種菇沿菌柄中心縱向掰成兩半，用解剖刀在菌蓋和菌柄交界處劃成田字形，取黃豆粒大一小塊菌肉組織，接在PDA培養基上。
四、培養純化
溫度控制在22℃－25℃之間，培養1－2天，長出白色絨毛狀菌絲體，4－5天通過篩選，挑出菌絲潔白、清晰、生長整齊、健壯的試管母種繼續培養，將有雜菌、長勢纖弱的淘汰。7－10天菌絲長滿斜面。
