食用菌母種主要采用人工選擇、誘變育種、雜交育種和原生質融合等手段獲得。作為一般制種專業戶，可以采用人工選擇方式分離培育母種，具體步驟與操作方法如下。
1、采集種源 從野生成人工栽培群體中，選擇有代表性的優良菇體作為種源。種菇的標準是：八成熟，朵形圓正、肉質肥厚，無病蟲害。采集1—2朵符合上述標準的種菇編上號碼，作為分離母種的材料。從栽培室采集的應標有原菌株代號。
2、培養基配制 瓊脂培養基又叫PDA培養基，常用配方為：馬鈴薯200—250克，瓊脂15—20克，葡萄糖20—25克，清水1000毫升。也可以加硫酸鎂1—1.5克，維生素B1微量，磷酸二氫鉀2—3克。先將馬鈴薯洗凈去皮，切成薄片，置于鋁鍋內加水煮沸30分鐘，撈起后用4層紗布過濾，取汁。然后將瓊脂加入汁內，邊加熱邊攪拌，讓瓊脂充分溶化；再將葡萄糖等加入，稍煮幾分鐘后，同樣用4層紗布過濾，取其汁液，將汁液趁熱裝入玻璃試管內。裝至管長的1／5，管口用棉花塞緊，或將汁液裝入玻璃三角瓶內，裝量20毫升。然后置于高壓鍋內，在98—108千帕／厘米的壓力下滅菌30分鐘左右。滅菌后及時取出，趁熱將試管斜排于桌上，冷卻后即成為固體斜面培養基。
3、母種分離方法 有孢子彈射、組織分離和基內分離3種方法。①孢子彈射法。將種菇表面消毒，吸干水分后，將菇體懸掛于裝有瓊脂培養基的三角瓶內，讓菇體內的袍子自然散落在培養基上萌發菌絲。也可以剪取一小決菇體，貼附在試管斜面培養基表面，讓孢子散落在培養基上萌發菌絲，即能獲得母種；②組織分離法。將消毒過的種菇，在接種箱內用手從菇柄處對半解開，或用刀片切開，使菇體形成對開。在菌蓋和菌柄交界處或菌褶處，用接種刀切取一小塊菇體，然后縱切成5×10毫米的小薄片，用接種針挑取一塊薄片，接入斜面培養基的中央，每支試管接種一小塊薄片，待其萌發菌絲，即可得到母種；③基內分離法。選擇已長菇的木段，削去樹皮及表層木質部，用70％的酒精消毒后，鋸成1厘米厚的薄片，放入0.1％的升汞水中消毒1—2分鐘，再用滅菌水洗去殘液。然后再將小薄片劈成0.5—1厘米寬的小條，接入斜面培養基中央，待長出菌絲后即得母種。也可以在已長菇的菌袋中，經消毒處理后，用接種針鉤取袋內色澤純、長勢旺的菌絲體，接種在試管斜面培養基中央，待萌發菌絲后，同樣獲得菌種。
4、適溫培養 通過上述不同方式將菌種分離接種于試管后，要及時將試管移入已消毒的培養箱或培養室內培養，溫度控制在25℃左右，使分離獲得的孢子或菌絲在適溫下發育。一般孢子彈射3—4天后孢子萌發成菌落，10天后菌絲長滿管；組織分離接種后2—3天，菌絲即萌發，并在培養基上蔓延生長；菇木分離接種后，7天菌絲即恢復生長。
5、選育提純 通過上述方法得到的菌絲，不一定都是優質的，還需要選育提純。因此，在菌絲萌發后，要認真觀察，挑選色澤純、健壯、長勢正常、無間斷的菌絲，在接種箱內連同培養基鉤取菌絲，接入另備的試管培養基上。在23—25℃的恒溫條件下，培養7—10天，待菌絲長滿管后，再進行觀察，從中擇優取用，即為“母代”母種。
6、轉管擴接 母代母種可以轉管擴接成“子代”母種。采用同樣的斜面培養基，每支可擴接30—50支子代母種。生產上供應的多為子代母種。它可以再次轉管擴接。一般每支可擴接成20—25支子代母種，但轉管次數不得超過5次。
7、出菇試驗 分離選育的母種，還必須進行出菇試驗。方法是：把母種接種于瓶或袋裝的木屑培養基上，根據各種菇耳種性對溫度的要求，進行適溫培養，直至出菇才證實可用于生產。
