一、母種的制作
1、培養基配方
黃豆芽500克(煮汁)，白糖20克，瓊脂20克，羊肚菌基腳～50克，水1升。
黃豆芽500克(煮汁)，白糖20克，瓊脂20克，水1升。
櫟木屑500克(煮汁)，白糖20克，瓊脂20克，水1升。
馬鈴薯200克(煮汁)，白糖20克，瓊脂20克，蛋白胨0.5克，牛肉膏0.5克，水1升。
蛋白胨1克，葡萄糖20克，瓊脂20克，酵母膏1克，磷酸二氫鉀1克，硫酸鎂1克，維生素B1，1克，水1升。pH值自然。
上述配方任選一組。將木屑或豆芽加水1升煮30分鐘，過濾取汁，并將余下的水補足1升，加入其它原料，煮至溶化后，按母種制作常規方法，分裝于18毫米×180毫米或20毫米×200毫米試管的1/5，塞上棉塞，使用高壓滅菌鍋徹底滅菌;在0.68千克壓力下維持60分鐘，自然冷卻至指針回到原位才可打開，放成斜面備用。
2、菌種分離
(1)分離方法
羊肚菌分離需要一種助生菌與羊肚菌菌絲共生時才能出菇，這種助生菌長期活動在土壤中，有時以芽孢菌形式出現，它為羊肚菌的原基形成和子實體生長發育起著至關重要的作用。因此從土壤中分離該菌比其它任何方式分離要好些，初學者可在四川綿陽市食用菌研究所購買培養好的羊肚菌優良母種，并參加現場培訓。
(2)操作過程
在羊肚菌生長的周圍，可見白色菌絲充滿土壤。從土壤中挑選這種菌絲容易成功。
浸提分離法：將基腳土用無菌水稀釋，澄清后用接種針蘸取少量溶液，滴到試管內的空白培養基上，塞上棉塞后取出培養。分離后，放在12～18℃溫度下培養觀察。一旦菌種分離成功，在以后的轉接過程中要小心，不能再讓雜菌感染，必須把好高溫滅菌關和接種消毒關，才能保證菌種質量和成活率。
3、轉接提純
待培養基表面余水干后才能使用，否則會被細菌感染。接種要求在接種箱內通過藥物滅菌進行，將第一代純母種挑取黃豆大一塊帶菌絲的培養基，放入空白培養基上，每支母種可接10～15支，母種只能擴種一次，不能多接或多擴，否則會影響子實體生長。
4、培養
接種后放在18～22℃溫度下避光培養，2～3天菌絲萌發，7天可長滿斜面培養基。
二、原種制作
1、培養基配方
櫟木屑50%，棉籽殼30%，麥麩 15%，白糖1%，石膏1%，過磷酸鈣1%，土2%，pH值自然。
櫟木屑75%，米糠或麥麩20%，白糖1%，石膏1%，過磷酸鈣1%，土2%，pH值自然。
稻草粉70%，麥麩25%，石膏1.5%，過磷酸鈣1.5%，土2%，pH值自然。
棉籽殼90%，木屑8%，土2%，pH值自然。
玉米芯50%，木屑30%，米糠15%，石膏1%，過磷酸鈣1%，土3%，pH值自然。
2、操作過程
按配方將原料混合均勻，加入清水，使含水量達65%時裝瓶。裝瓶要求松緊一致，裝瓶后塞上棉塞封口。
3、滅菌
高壓滅菌在0.68千克壓力下維持1小時，常壓滅菌在100℃溫度下保持6～8小時。
4、接種與培養
接種在接種箱內經消毒后，每支母種可接種原種5～10瓶。接種后放在18～22℃溫度下避光培養，培養期間盡量避免強光刺激，菌齡以不超過50天為好。
三、栽培種制作
1、培養基配方
櫟木屑75%，米糠或麥麩20%，白糖1%，石膏1%，過磷酸鈣1%，土2%，pH值自然。
棉籽殼75%，麥麩20%，石膏1%，過磷酸鈣1%，土3%，pH值自然。
稻草粉75%，麥麩15%，過磷酸鈣2%，土3%，pH值自然。
玉米芯80%，米糠15%，石膏2%，過磷酸鈣1%，土2%，pH值自然。
農作物藤稈粉75%，米糠10%，麥麩10%，白糖1%，石膏1%，過磷酸鈣1%，土2%，pH值自然。
2、操作過程
按配方將原料混勻后，加水調至含水量為65%，裝瓶，滅菌接種，培養，操作方法同上述原種。經1個月菌絲長滿瓶后就可用于生產栽培。
