2、單孢分離 就是將采集到的孢子群單個分開進行培養，讓它單獨萌發成菌絲而獲得純種的方法，單孢子分離的方法，按分離的手段可分為以下三種。
?。?）稀釋分離法：這是通過不斷稀釋孢子懸浮液，使孢子分散最終孢子濃度控制在300-500個孢子/毫升，吸取0.1毫升的孢子液注入平板均勻涂布，分散孢子各自萌發形成單孢菌落，其步驟如下：
?、僦苽錈o菌水試管：取10支試管，其中1支裝100毫升蒸餾水，其它9支裝9毫升蒸餾水，經高壓滅菌即成無菌水。
?、谥奇咦討乙海喝∫恍K收集有孢子的濾紙條，浸入10毫升無菌水試管中， 搖振使孢子分散成懸液，用無菌1毫升移液管吸取1毫升孢子懸液于第2支試管中， 搖振使其分期，再從第2支試管中吸取1毫升注入第3支試管中， 如此反復稀釋直到孢子濃度達到300-500個孢子/毫升，備用。
?、壑婆囵B基平板：配制PDA培養基，裝入三角瓶中進行高壓滅菌， 準備倒平板的培養皿也經過高壓滅菌備用，待已滅菌的PDA冷卻至50-60℃時，在無菌操作下倒15-20 毫升PDA至培養皿中，培養皿放平，晝使培養基表面光滑，厚度一致。
?、苕咦油坎迹涸跓o菌操作下，吸取0.1毫升的孢子懸浮液滴在平板培養基表面上，使用T氏棒把孢子均勻涂布在平板上，蓋上刺激菌絲培養皿，放置于24-25℃恒溫箱中培養。
?、萏暨x單孢子萌發菌落：一般孢子經過５天的培養開始萌發長出菌絲，培養皿經過顯微鏡的鏡檢確定孢子萌發的菌落是由單個孢子萌發成長而成的，可使用打孔器進行打孔把該菌落移接至新鮮的PDA斜面試管中繼續培養。 打孔器的外徑應小于顯微鏡的視野范圍，而且打孔之前須檢查該菌落周圍是否有孢子或其它菌落，晝使打孔不會觸及周邊的孢子或菌落，確保純種。
?。?）毛細管法：孢子懸浮液經過稀釋，使用毛細滴管把孢子懸浮液滴一小滴于皿蓋內，晝使每一滴只含有一個孢子，從而達到單孢子分離，其方法如下：
?、冁咦討腋∫褐苽渫♂尫蛛x法，孢子濃度控制在200-300個孢子/毫升。
?、诿毜喂苤苽洌喝崈舻牟ＡЧ茉诰凭珖姛羯舷壤赏鈴?毫米的細管， 稍冷卻后再加熱并迅速拉長，使管尖內徑約200微米，剪斷即成毛細滴管，在滴管后端塞棉花， 裝入消毒盒中后進行滅菌備用。
?、埸c樣鏡檢：用毛細滴管吸取經稀釋的孢子懸浮液約0.1毫升(可滴30滴)，在無菌操作下，快速點于皿蓋內壁的標記圈中央，滴液應小于低倍鏡的視野， 點樣后的培養皿仍蓋在有水瓊脂的皿底上，貼膠布固定后再用低倍銳檢查皿蓋內壁的的液滴，確定是單孢者，即在皿蓋上標上記號。
?、芘囵B基推貼及刺激培養：使用接種針取一小塊PDA培養基(約2×2毫米方塊) 推貼至標記為單孢子的液滴，使液滴中的孢子能夠吸附到培養基邊緣。 將事先培養好蘑菇氣生菌絲的平板培養皿蓋取下，套在菌絲平板的底部，再把已分離并推貼好的培養基的皿蓋罩在套有菌絲平板的玻璃皿上，使兩個皿蓋對接，貼膠布封口(要留0.5厘米縫用作通氣)，這樣就形成一個刺激單孢子萌發的培養室，置培養箱中24 ℃下培養，待單孢子萌發，及時撕下膠布，用接種鏟挑取已萌發的單孢菌絲貼塊，移接到新鮮PDA斜面試管中，置24℃恒溫箱中培養，即可區得單孢純種。
