栽培種，又叫生產種，即把原種再次擴接到栽培種培養基上，經過培育得到的菌絲體。培育雙孢菇栽培種多以麥粒為原料，具有制作簡單、發菌快、易于播種的優點。(1)原料處理
牛糞破碎處理后過篩，按1:1.2加水拌勻，堆積發酵，每天翻堆一次。約20天牛糞粉變為褐色，具有正常發酵草料的清香氣味，曬干備用。無受潮的小麥，充分泡透后撈出，適當遮陽、通風，發現表皮發干時輕噴細霧濕潤，24小時后即可發芽。待麥芽長至1～2厘米時，即可使用。
選擇無蟲蛀的小麥，倒入沸水中煮20～25分鐘（水用石灰調ph值8～9），撈去秕麥等漂浮雜物并不斷攪拌，煮至麥粒無白心時，立即?；饘Ⅺ溋瞥?，切忌將麥粒表皮煮破。在水泥地面晾至表面無水跡。
(2)基質配制
配方為麥粒（以干品計）100千克、牛糞粉30千克、石膏粉1千克、碳酸鈣1.5千克。將麥粒與牛糞粉按1：0.2混合，同時拌入其他輔料，注意使牛糞全部粘附到麥粒上，水分不足時適量噴水。剩余牛糞粉待用。
(3)裝瓶滅菌
裝料可用長28厘米、寬15厘米、厚5絲的聚丙烯折角袋。小批量生產多利用酒瓶、葡萄糖玻璃瓶等，裝瓶滅菌。為降低生產成本，可用500毫升輸液瓶。先裝一把牛糞粉在瓶底，1～1.5厘米高，再裝麥粒。裝瓶時稍墩瓶，使麥粒至瓶肩以下1厘米處，然后再裝入1～2把牛糞粉，并用工具攤平、壓實。將瓶口處的雜物擦洗干凈，塞入棉塞。
采用高壓滅菌方法，壓力維持在0.15兆帕，保持2～2.5小時。滅菌結束后，壓力下降至零后，可取出料瓶，降溫至30℃時即可接種。
(4)菌種培養
雙孢菇菌絲的適宜生長溫度為22～26℃，因此，培養室內應盡量保持此溫度，堅決避免出現30℃以上的溫度，以免細菌污染。同時培養室還要遮光，保持室內黑暗。在培養期間，要利用夜間通風，保持室內空氣新鮮；每隔3～4天，噴灑一次殺菌劑與殺蟲劑；每7～10天檢查1次，挑出被雜菌污染的菌種，保持菌種的純度。正常情況下，25～30天菌絲即可長滿全瓶，繼續培養3～5天，就可用于生產。
(5)剔雜處理
接種后第3天即開始檢查剔雜，發現任何非雙孢菇菌絲的菌瓶，隨即移出室外。有鏈孢菌污染的，應用方便袋從上往下套住菌瓶，慢慢移出。對一般雜菌的污染，可噴施藥物后將料倒出，曬干后再次利用；對鏈孢菌污染，應遠離培養室倒料，并予焚燒或深埋?？掌坑?0℃以上熱水燙殺，洗凈后再用。
經35～45天菌種完成發菌，暫時不用的菌種應低溫存放，一般保持2～4℃條件即可。
